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La notoriedad de la técnica CRISPR
El Premio Nobel de Química del año 2020 fue otorgado a dos científicas, Jennifer A. Doudna y Emmanuelle Charpentier, por haber desarrollado una herramienta genética denominada comúnmente la técnica CRISPR que permite cortar y pegar el ADN en cualquier célula, incluso la humana. Al respecto, la Dra. Jennifer Doudna comentó: “inventamos una tecnología para editar el genoma…”. Así comenzó la fama de esta tecnología.
Recientemente, el Dr. Thomas R. Cech, Premio Nobel (1989), investigador y experto en ARN y los procesos de transcripción genética en la Universidad de Colorado, miembro del Board de Merck & Co. y en cuyo laboratorio se entrenó Jennifer Doudna en los años 90, manifestó que para él “las vacunas de ARN mensajero y las basadas en la tecnología CRISPR son los más extraordinarios avances científicos desde que el hombre llegó a la Luna”.
La Dra. Doudna es una estadounidense, investigadora y profesora de la Universidad de California, Berkeley y la Dra. Emmanuelle Charpentier es francesa y la actual directora de la Unidad de Investigación Max Plank para la Ciencia de los Patógenos en Berlín. Ellas decidieron trabajar en colaboración con la idea de comprender el misterioso sistema (CRISPR) que permitía a las bacterias inmunizarse contra los virus. En su trabajo, que les tomó tiempo, descifraron los mecanismos inmunológicos de CRISPR-Cas9 y crearon una herramienta de la ingeniería genética de fácil realización y que se ejecuta en un tiempo mucho menor que el requerido por las técnicas de ingeniería genéticas de uso corriente como el RT-PCR, método estándar y el más usado para identificar nucleótidos. El RT-PCR es más complejo, costoso y su utilización está restringida al laboratorio. En cambio, la técnica CRISPR-Cas para editar/cambiar el ADN genómico debido a su simplicidad y a que su procedimiento no está sujeto a ser practicado en un laboratorio; es así que los métodos de ingeniería genética aplicados hasta ese momento están siendo superando con creces por CRISPR-Cas. A la sazón, existe un antes y un después de este descubrimiento.
La edición del genoma CRISPR-Cas, según Doudne y col. (2019), “podría recordarse en la historia como la tecnología más influyente en las ciencias de la vida…Desde la década de 1990, hemos podido leer la secuencia de ADN de los genomas. Con CRISPR, la humanidad ahora tiene el poder de reescribir las secuencias de al menos pequeñas regiones del genoma. Horribles enfermedades genéticas y humanas, como la anemia falciforme, podrían ser potencialmente “borradas” del genoma humano en el futuro”. En este trabajo los autores narran y explican con detalle la estrategia experimental que implementaron, que no fue fácil y tomó tiempo, y muestran los resultados que fueron encontrando en cada paso. Una lectura pulcra y muy sencilla de comprender.
Igualmente, señalan una alerta sobre la caja de Pandora que representa el conocer cómo Cas9 corta el ADN, en donde la ética juega un papel primordial para los científicos y la sociedad en general. La caja de Pandora fue abierta y el hecho ético transgredido en 2018 por el científico chino He Jiankui, quién creó los primeros bebés modificados genéticamente cuando editó el genoma de embriones humanos para que fueran inmunes al virus del sida al desactivar el gen CCR5 que induce una resistencia al VIH. Sin embargo, no se conocen las consecuencias de este cambio genético en el futuro de esos bebés. No es un método comprobadamente seguro, todavía. El aspecto ético no había sido mencionado por el comité del Premio Nobel.
Las gemelas intervenidas genéticamente nacieron sanas y su identidad no es públicamente conocida. El científico afirmó que “la cirugía genética funcionó de manera segura” y agregó “no se cambió ningún gen excepto el que previene la infección por VIH”, hecho que se comprobó al secuenciar los genes de los bebés antes y después de nacer. Posteriormente, nació un tercer bebé modificado genéticamente, pero no recibió mucha notoriedad. Un paso que sigue es crear humanos mejorados.
Fue un acto ilegal por lo que fue condenado a 3 años de cárcel y pagar 380 mil euros; además fue vetado para realizar cualquier actividad en salud. Después de tres años de cárcel fue liberado. Pero, esta historia tiene adláteres. Si bien la responsabilidad recayó en He Jiankui y su equipo, muchos investigadores sabían del proyecto, lo alentaron e incluso algunos participaron en el proyecto porque tenían ambiciones comerciales. Estos colaboradores internacionales no fueron sancionados ni censurados, aunque estos procedimientos están prohibidos por la FDA.
Francisco J.M. Mojica: su historia
Antes de ver en qué consiste la tecnología CRISPR, es importante recordar los antecedentes de este método que permite cortar y pegar un gen o un trozo de ADN al genoma, de allí el nombre de tecnología para editar el genoma.
Las investigaciones comenzaron en la Universidad de Alicante – España con el microbiólogo y científico Francisco J. M. Mojica quién descubrió el CRISPR, unas secuencias repetidas y espaciadas en organismos unicelulares (bacterias y arqueas) de origen distinto al organismo objeto de estudio; en posteriores experimentos, él descubrió que estas secuencias jugaban un papel en los mecanismos de inmunidad de estas bacterias. En el año 2000, Mojica acuñó el acrónimo CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palyndromic Repeats), o “Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas” en español. Lo raro de estas secuencias es que provenían de un organismo foráneo y por eso llamaron su atención, historia que cuenta en una revisión de Mojica FJM y Rodríguez Valera F. (2016). Dicho nombre fue aceptado por la comunidad científica.
En 2005, M. Mojica, publica su descubrimiento sobre las repeticiones cortas de ADN, con un espaciado regular entre unidades recurrentes, llamadas CRISPR y su relación con la inmunidad en bacterias. Luego, se comprueba que es un mecanismo natural que utiliza la memoria inmunológica de las bacterias para defenderse del ataque de los virus. La memoria adaptativa permite a la bacteria recordar la secuencia del ADN viral del invasor y, por ende, tener la capacidad de defenderse cuando de nuevo fuera atacada. Esta memoria es responsable de activar una enzima/endonucleasa llamada Cas9 que reconoce la cadena de ADN, la corta e impide la replicación del virus.
Una vez que el ADN es cortado pueden ocurrir dos cosas: se pueden pegar los extremos del ADN o se pueden introducir moldes de ADN que sean capaces de editar la secuencia a voluntad. Aquí comienza el trabajo de Doudna y Charpentier para darle aplicación al descubrimiento de Mojica, que finaliza en la creación de una herramienta molecular de la ingeniería genética, CRISPR-Cas9, que permite corregir o editar el genoma de cualquier célula, incluso las células humanas como fue el caso de los embriones humanos intervenidos genéticamente.
En la revisión de Mojica y Rodríguez Valera F (2016) se observa la participación de una cantidad importante de investigadores colaterales que aportaron conocimiento en esta lenta cadena de eventos para llegar a la relación final entre CRISPR y la inmunidad adaptativa.
La herramienta genética CRISPR
En junio de este año se cumplieron 10 años desde que Charpentier y Doudna publicaron su trabajo sobre la técnica CRISPR-Cas en la prestigiosa revista Science (2012). Desde entonces mucho ha avanzado esta área del conocimiento. Las investigadoras, en ese trabajo, “identificaron un mecanismo de interferencia de ADN que involucra una estructura de ARN dual que dirige una endonucleasa o enzima Cas9 para introducir trozos de doble cadena específicas del lugar en el ADN objetivo”; además, agregan: “La endonucleasa Cas9 se puede programar con un ARN guía diseñado como una sola transcripción para apuntar y escindir cualquier secuencia de dsDNA de interés. El sistema es eficiente, versátil y es programable porque se puede cambiar la secuencia de unión del ADN en el ARN quimérico guía…”, así resumen los autores el trabajo publicado en 2012.
Es decir, que una estructura de dos ARN dirige una endonucleasa (enzima o proteína Cas9 en esta ocasión) programada para escindir o cortar el ADN en el lugar específico, lo que indica que es un sistema programable con ARN para editar un genoma. La endonucleasa es llamada “tijera genética”.
Igualmente, como se mencionó, se pueden introducir secuencias que se deseen insertar en la parte del ADN que se quiere reparar, entonces, la maquinaria de la célula reemplaza la parte cortada con las nuevas secuencias insertadas, un mecanismo de aplicación práctica inspirado en el sistema inmune de las bacterias. De esta manera dichos cambios en el genoma pueden transformar la expresión genética o identificar y modificar las funciones de los genes o corregir genes defectuosos, entre múltiples aplicaciones.
Se podría decir que Martínez Mojica es el padre de CRISPR amén de ser quién acuño el nombre, pero, como él mismo comentó refiriéndose al Premio Nobel que no le otorgaron en el año 2020, “la familia CRISPR es muy grande y seleccionar a los más importantes era muy difícil y por eso se inclinaron por Charpentier y Doudna que descubrieron su aplicación más inmediata y universal como fue la edición genética”. Su mérito reside en haber concebido el sistema CRISPR como una herramienta para editar genes.
CRISPR y sus aplicaciones en la pandemia de covid-19
La tecnología CRISPR tiene un gran potencial en la medicina, alimentación, agricultura y medio ambiente. Como mencionó el presidente de la American Chemical Society “las implicaciones de la tecnología CRISPR son realmente sorprendentes”. Ese reconocimiento viene porque las investigadoras eran ambas químicas de profesión.
La edición del ADN del organismo humano puede suponer una gran ventaja, por ejemplo, para las enfermedades genética; sin embargo, de igual forma, puede ser una espada de doble filo al convertirse en una tentación para actuar sin ética como lo hizo el científico chino. ¡Avanzamos mucho, pero debemos hacerlo con cuidado!
Este conocimiento ha generado una gran respuesta de la comunidad científica que ha abarcado numerosas áreas y se han publicado miles de experimentos en numerosos organismos como mariposas, hongos, tomates y humanos, entre otros. Este huracán, no previsto, ha servido de base para acelerar los conocimientos en la biotecnología de la genética y, más específicamente, para estudiar cuáles son las soluciones necesarias para enfrentar la pandemia mediante el diseño de metodología con el fin de diagnosticar, tratar y prevenir la covid-19.
Diagnóstico y tratamiento
La detección del virus y el desarrollo de terapias para el tratamiento han sido los campos más investigados, por lo cual no escribiremos sobre las vacunas.
El área de diagnóstico es la que ostenta mayor desarrollo porque, en la necesidad de conocer la circulación viral y las mutaciones en las variantes surgidas en la pandemia, se ha intensificado la necesidad de desarrollar pruebas para detectar ácidos nucleicos que sean económicas, fáciles de escalar, capaces de hacerse fuera del laboratorio, rápidas, sensibles y específicas y la tecnología CRISPR ofrece estas ventajas/características. La precisión y la rapidez de las pruebas de diagnóstico es clave para conocer el grado de propagación de un virus tan eficiente y conocer la extensión en territorios en donde ha llegado la pandemia. Sin embargo, ninguna ha salido de los laboratorios para una aplicación masiva.
En general, la utilización de CRISPR-Cas en el diagnóstico del virus SARS-CoV-2 está desplazando al RT-PCR porque ha alcanzado su especificidad y sensibilidad y porque se resolvieron sus limitaciones en cuanto a equipos especializados de alto costo, el tiempo para obtener resultados y las posibilidades de realizarse fuera de los laboratorios; una demostración del esfuerzo empleado aquí sería el método que recientemente salió a la luz, cuyo proceso es en un solo paso y se denomina AIOD-CRISPR.
Es interesante comenzar por el principio. Entre las primeras tecnologías desarrolladas se encuentran las conocidas como el sistema SHERLOCK, desarrollado en el laboratorio de Feng Zhang, investigador de renombre del Instituto Broad del MIT y la segunda es la técnica llamada DETECTR que fue desarrollada en el laboratorio de la Dra. Doudna en Berkeley. En un duelo entre ambos investigadores, sus técnicas han sido optimizadas por cada uno, amén de haber sido la base de otras versiones. Feng Zhang la mejoró eliminado el paso de extracción y aislamiento del ARN y la llamó STOPCovid y la Dra. Doudna desarrolló una prueba usando CRISPR-Cas13a, que se puede leer con un microscopio instalado en un teléfono móvil. No necesita la amplificación viral, es sensible, precisa y capaz de procesar muchas muestras en 5 minutos.
Tanto Zhang como Doudna crearon sus propias empresas con el fin de desarrollar y comercializar este tipo de herramientas de diagnóstico que dio su fruto en mayo de 2020, cuando la empresa de Zhang, con su kit de pruebas SHERLOCKTM CRISPR SARS-CoV-2, fue quien logró tener la primera autorización de la FDA para su uso de emergencia. Fue un momento histórico para la empresa.
No podemos dejar de mencionar someramente la integración de este tipo de ensayos a una plataforma de chips desechables. Uno de estos enfoques es el CRISPR Digital Rapid (RADICA) que utiliza CRISPR-Cas12a y no solo puede identificar el virus sino también cuantificarlo como lo hace el PCR-RT y todo ocurre en un solo paso.
Esto es un esbozo muy resumido para demostrar el grado de complejidad del desarrollo de estas técnicas para la identificación de covid-19. Al mismo tiempo es interesante agregar que la evolución has sido sorprendentemente acertada, lo que indica que es una tecnología con mucho porvenir.
Con respecto al tratamiento para COVID-19 basado en esta técnica existen trabajos, cada vez en mayor número, provenientes de empresas farmacéuticas para tratar enfermedades graves como cáncer, procesos hematológicos y en medicina regenerativa que indican los muchos esfuerzos invertidos. Incluso se han establecido estrategias de colaboración entre las empresas con el fin de acelerar y expandir la tecnología CRISPR. A la vez, cada vez más, están apareciendo investigaciones involucrados en el tema que incluyen la academia, en el campo de la terapia aplicada a enfermedades como infecciosas u otras como la fibrosis quísticas o desórdenes metabólicos; por ejemplo, en 2021 aparecieron bastantes estudios clínicos, en proceso o terminados, en las áreas mencionadas. La medicina está asumiendo los avances en los cambios tecnológicos.
En el caso de la covid-19, la vía para llegar a los estudios clínicos o a la aplicación directa es más complejo porque estos tratamientos o vacunas necesitan muchos estudios sobre las consecuencias de introducir en el organismo humano un material genético sobre lo que no se conoce todo más que teóricamente, y sus implicaciones en la vida humana, por ejemplo, se pudieran generar mutaciones en el virus agresor o, quizás, otros cambios genéticos en el cuerpo. Aunque, la tecnología CRISPR es muy precisa por lo que representan un gran potencial, sin embargo, su seguridad necesita ser comprobada in vivo.
Por ejemplo, es fundamental investigar los efectos nocivos del uso del ARN guía, del sistema CRISPR-Cas o del método PAC-MAN en la fisiología del huésped. Un aspecto importante son que las mutaciones de escape viral asociadas a la enzima Cas9 o aquellas inapropiadas pueden ocurrir en cualquier virus al escapar del tratamiento. Por lo tanto, el sistema CRISPR-Cas podría ser arriesgado y no rentable en infecciones virales.
El método PAC-MAN fue desarrollado en Standford, probado en células humanas del pulmón, al cual se le incorporó un análisis bioinformático y que ha demostrado ser capaz de degradar eficazmente las secuencias del SARS-CoV-2 y del virus influenza A, específicamente, pudo eliminar no solo el SARS-CoV-2 sino a todos los coronavirus en un 90%. Este método utiliza la enzima Cas13. En resumen, concluyen los autores, “nuestra estrategia PAC-MAN representa un nuevo enfoque potencialmente poderoso para inhibir la función viral y su replicación, y predecimos que podría ser útil para una amplia gama de amenazas virales emergentes y en circulación”; sin embargo, tiene el inconveniente de no poseer un vehículo eficiente para su administración. Algunos opinan que esta estrategia hasta podría ser mejor que la vacunación para inducir inmunidad.
Por otro lado, las terapias basadas en el sistema CRISPR-Cas13 están siendo estudiadas y podrían superar el desafío que representa covid-19. En el caso de la enzima Cas13d, una modificación de Cas13, directamente la enzima cambia alguna de las bases de los ribonucleótidos del ARN, editándolo e incluyendo una mutación. Este sistema es flexible y versátil por la capacidad de diseñar el ARN guía para apuntar hacia diferencias entre las variantes del virus. Por otro lado, utiliza el adenovirus (AAV) como vehículo que unido al pequeño tamaño del Cas13d forman una matriz adecuada para la administración de “todo en uno”, lo que lo hace un enfoque novedoso, sencillo, flexible y rápido para el tratamiento y prevención de la infección de virus de ARN. En consecuencia, el sistema CRISPRCas13d es uno de los que tiene más potencialidad.
Es importante recordar que se están aplicando una serie de tratamientos como el remdesivir y otros. Un artículo de la Dra. Alicia Ponte-Sucre describe los medicamentos utilizados para tratar la covid-19 hasta el momento.
En fin, el sistema CRISPR-Cas tiene un mañana seguro para el diagnóstico, pero un potencial futuro para el tratamiento y posiblemente para la prevención, acompañados de la dificultad de necesitar más investigaciones en la seguridad de su aplicación en seres humanos. Sus posibilidades en el diagnóstico son muy amplias amén de ser un campo bastante estudiado para abrir caminos en el combate de otras epidemias.
¡El tema es muy interesante y pudiera depararnos muchos cambios para la raza humana!
Irene Pérez Schael